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生物光学显微镜种类(篇)doc

gecimao 发表于 2019-05-29 06:47 | 查看: | 回复:

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  生物光学显微镜种类(4篇) 以下是网友分享的关于生物光学显微镜种类的资料4篇,希望对您有所帮助,就爱阅读感谢您的支持。 篇一:生物光学显微镜种类 2.光学显微镜技术有哪些新发展?它们各有哪些突出优点?为什么电子显微镜不能完全代替光学显微镜? .答:(1)光学显微镜技术的新发展 光学显微镜技术在细胞学研究中发挥了重要作用,随着多种现代生物学技术 与光镜技术的结合,使光学显微镜展现出了新的活力,也有了新的发展。光学显微镜技术主要有普通复式光学显微镜技术、荧光显微镜技术、激光扫描共焦显微镜技术、相差和微分干涉显微镜技术、录像增差显微镜技术等。 (2)光学显微镜技术的优点 普通复式光学显微镜使用简单,操作方便,可以配备多套仪器使用,如暗视 野显微镜。 荧光显微镜是目前在光镜水平上对特异性蛋白质等生物大分子定性、定位的 最有利工具。 激光扫描共焦显微镜成像清晰,分辨率高,可以通过光学切片观察较厚样品 的内部结构。 相差和微分干涉显微镜不需要染色就可以观察活细胞甚至研究细胞核、线粒 体等细胞器的动态,并且具有很强的立体感。 录像增差显微镜分辨率比普通光镜提高了一个数量级,而且可在高分辨率下 研究活细胞。 光学显微镜的优点如下表所示: 光学显微镜技术 主要特点 突出特点 荧光显微镜 样品进行荧光标记 只有激发荧光可以成像 激光扫描共焦显微镜 光通过一个小孔或裂缝成图像比较清晰,分辨率提高 像,只有焦平面的光成像 1.4~1.7倍 相差显微镜 增加一个“相差板”,夸大不需要染色,可观察活体 样品密度相位差 微分干涉显微镜 棱镜折射,增加样品密度的增加反差,更具立体感 明暗区别 暗视野显微镜 黑暗背景下利用散射光观细胞及细胞器边缘轮廓清晰 倒置显微镜 察 增加了集光器和载物台的距离, 照射系统和物镜颠倒位置 可放置培养皿观察 录像增差显微镜 计算机辅助微分干涉显微提高了分辨率,可观察颗粒的运 镜 动 (3)电子显微镜不能完全代替光学显微镜的原因 尽管电子显微镜具有分辨率高这一光学显微镜无法比拟的优越性,但光学显 微镜在科研中的地位是不可取代的。这可以从以下几个方面进行说明。 细胞生物学是在显微、亚显微和分子三个结构层次上研究细胞的,在显微 水平上研究细胞需用光学显微镜,在亚显微水平上研究细胞需用电子显微镜,因此二者是在细胞的不同显微水平上观察细胞结构的。 普通光学显微镜样品易制备,而电子显微镜对样品要求很高。 电子显微镜不能观察活细胞及其动态变化。 普通光学显微镜操作简单,对环境和设备的要求没有电子显微镜高。 篇二:生物光学显微镜种类 光学显微镜的几种特殊显微镜 一.暗视野显微镜 暗视野显微镜由于不将透明光射入直接观察系统,无物体时,视野暗黑,不可能观察到任何物体,当有物体时,以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体,照明光大部分被折回,由于物体(标本)所在的位置结构,厚度不同,光的散射性,折光等都有很大的变化。 暗视野显微镜在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射,形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的,视野中直径大于 0.3m的微粒将光线散射,其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。 二.相位差显微镜 相差显微镜是荷兰科学家Zermike于1935年发明的,用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本,因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同,光波通过时,波长和振幅并不发生变化,仅相位发生变化(振幅差),这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差,并利用光的衍射和干涉现象,把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑, 用带相板的物镜代替普通物镜,并带有一个合 轴用的望远镜。 相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的 功能:将直射的光(视野中背景光)与经物体衍 射的光分开;将大约一半的波长从相位中除 去,使之不能发生相互作用,从而引起强度的变 化。 相差显微镜(phasecontrast microscope) 由P.Zernike于1935年发明,并因此获1953 年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以相差显微镜 观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是,利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别,经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片,有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: 1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种: 1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。 2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。 相差显微镜使用中的几个问题: (1)相位倒转 当nn时得到象的明暗反差正好相反,称为相位倒转。当相位差δ=0时是无法识别的,随着δ的增大反差变大,当δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值(高反差)物镜时,这个转变值约为0.55λ,用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的光程差。 (2)晕轮和渐暗效应 在相差显微镜成象过程中,某一结构由于相位的延迟而变暗时,并不是光的损失,而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮。这是相差显微镜的缺点,它妨碍了精细结构的观察,当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应,指相差观察相位延迟相同的较大区域时,该区域边 缘会出现反差下降。 (3)样品厚度的影响 当进行相差观察时,样品的厚度应该为5μm或者更薄,当采用较厚的样品时,样品的上层是很清楚的,深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰。 (4)盖玻片和载玻片的影响 样品一定要盖上盖上盖玻片,否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。相差观察对载玻片和盖玻片的玻璃质量也有较高的要求,当有划痕,厚薄不均或凹凸不平时会产生亮环歪斜及相位干扰。另外玻片过厚或过薄时会使环状光阑亮环变大或变小。 三.视频显微镜 将传统的显微镜与摄象系统,显示器或者电脑相结合,达到对被测物体的放大观察的目的。 最早的雏形应该是相机型显微镜,将显微镜下得到的图像通过小孔成象的原理,投影到感光照片上,从而得到图片。或者直接将照相机与显微镜对接,拍摄图片。随着CCD摄象机的兴起,显微镜可以通过其将实时图像转移到电视机或者监视器上,直接观察,同时也可以通过相机拍摄。80年代中期,随着数码产业以及电脑业的发展,显微镜的功能也通过它们得到提升,使其向着更简便更容易操作的方面发展。到了90年代末,半导体行业的发展,晶圆要求显微镜可以带来更加配合的功能,硬件与软件的结合,智能化,人性化,使显微镜在工业上有了更大的发展。 四.荧光显微镜 在萤光显微镜上,必须在标本的照明光中,选择出特定波长的激发光,以产生萤光,然后必须在激发光和萤光混合的光线中,单把萤光分离出来以供观察。因此,在选择特定波长中,滤光镜系统,成为极其重要的角色。 萤光显微镜原理: (A) 光源:光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (B) 激励滤光源:透过能使标本产生萤光的特定波长的光,同时阻挡对激发萤光无用的光。 (C) 萤光标本:一般用萤光色素染色。 (D) 阻挡滤光镜:阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光,在萤光中也有部分波长被选择透过。 五.偏光显微镜 偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色法来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。 主要特点 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。双折射性是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域,在生物学和植物学也有应用。 基本原理 偏光显微镜的原理比较复杂,在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件:起偏镜,检偏镜,补偿器或相位片,专用无应力物镜,旋转载物台。 检术方式 1、正相镜检(Orthscope) 又称无畸变镜检,其特点是使用低倍物镜,不用伯特兰透镜(BertrandLens),被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小,推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。 2、锥光镜检(Conoscope) 又称干涉镜检,研究在偏振光干涉时产生的干涉图样,这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中,用强会聚偏振光束照明。 装置要求 1、光源 最好采用单色光,因为光的速度,折射率,和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。 2、目镜 要带有十字线、聚光镜 为了取得平行偏光,应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。 4、伯特兰透镜 聚光镜光路中的辅助部件,这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。 检术要求 1、载物台的中心与光轴同轴。 2、起偏镜和检偏镜应处于正交位置。 3、制片不宜过薄。 六.超声波显微镜 超声波扫描显微镜的特点在于能够精确的反映出声波和微小样品的弹性介质之间的相互作用,并对从样品内部反馈回来的信号进行分析!图像上 (C-Scan)的每一个象素对应着从样品内某一特定深度的一个二维空间坐标点上的信号反馈,具有良好聚焦功能的Z.A传感器同时能够发射和接收声波信号。一副完整的图像就是这样逐点逐行对样品扫描而成的。反射回来的超声波被附加了一个正的或负的振幅,这样就可以用信号传输的时间反映样品的深度。用户屏幕上的数字波形展示出接收到的反馈信息(A-Scan)。设置相应的门电路,用这种定量的时间差测量(反馈时间显示),就可以选择您所要观察的样品深度。 七.解剖显微镜 解剖显微镜,又被称为实体显微镜或立体显微镜,是为了不同的工作需求所设计的显微镜。利用解剖显微镜观察时,进入两眼的光各来自一个独立的路径,这两个路径只夹一个小小的角度,因此在观察时,样品可以呈现立体的样貌,成像清晰和宽阔,又具有长工作距离。解剖显微镜的光路设计有两种: The Greenough Concept和The Telescope Concept。解剖显微镜常常用在一些固体样本的表面观察,或是解剖、钟表制作和小电路板检查等工作上。 它有如下特点: 1. 双目镜筒中的左右两光束不是平行,而是具有一定的夹角——体视角(一 般为12度---15度),因此成像具有三维立体感; 2. 像是直立的,便于操作和解剖,这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故; 3. 虽然放大率不如常规显微镜,但其工作距离很长 4. 焦深大,便于观察被检物体的全层。 5. 视场直径大。 目前立体镜的光学结构是:由一个共用的初级物镜,对物体成像后的两光束被两组中间物镜——变焦镜分开,并成一体视角再经各自的目镜成像,它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的,因此又称为“连续变倍体视显微镜”(Zoom—stereo microscope)。随着应用的要求,目前体视镜可选配丰富的选购附件,如荧光,照相,摄像,冷光源等等。 篇三:生物光学显微镜种类 显微镜 原理: 物镜的凸透镜焦距小于目镜的凸透镜的焦距。物体通过物镜成倒立、放大的实像。该实像又通过目镜成正立、放大的虚像。 光镜是如何使微小物体放大的呢? 被检标本是放在物镜下方的1~2倍焦距之间的,上方形成一倒立的放大实相,该实相正好位于目镜的下焦点(焦平面)之内,目镜进一步将它放大成一个虚像,通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处,在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的,该 1 虚像看起来好像在离眼睛25cm处。 HE染色: 苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ,简称HE染色法。苏木精染液为碱性 ,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ;伊红为酸性染料 ,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。 数值孔径: 数值孔径又叫做镜口率,英文全称Numerical Aperture,简写为 NA。 其大小由下式决定:NA = n * sin α,其中 n 是被观察物 2 体与物镜之间介质的折射率;α 是物镜孔径角(2α)的一半。物镜孔径角是指: 分辨力: 显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定,物镜的分辨力就是显微镜的分辨力,而目镜与显微镜的分辨力无关。物镜的分辨可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。 放大率或放大倍数: 一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大 3 倍数的乘积。目镜只能起放大作用,不会提高显微镜的分辨率。 聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响: 它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角,否则就不能充分利用物镜所镜中的,可以调节开孔大小的可变孔径光阑,用来调节照明光束孔径,以与物镜孔径角匹配。 圈调至最大)。 4 暗视野显微镜 暗视野显微镜(dark field microscope)的聚光镜中央有挡光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。 丁达尔效应: 当一束光线透过胶体,从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”,这种现象叫丁达尔现象,也叫丁达尔效应(Tyndall effect)、丁泽尔现象、丁泽尔效应、廷得耳效应。 在暗室中,让一束平行光线通过一肉眼看来完全透明的胶体,从垂直于光束的方向,可以观察到有一浑浊发亮的光柱, 5 其中有微粒闪烁,该现象称为丁达尔效应。 暗视野显微镜基本结构是将普通显微镜光学组加上挡光片。普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的,支架的口径适于安装暗视野聚光器,即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光时,可用厚黑纸片制作一个中央遮光板,放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上,也能得到暗视野效果。挡光片是用来挡住光源中间的光线,让光线只能从周围射入标本,大小约和光圈大小相同。不同倍率用不同的光圈,所以要制作不同的挡光片。 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子(普遍光 6 学显微镜的最高分辨率为200nm),分辨率可比普通显微镜高50倍。即可以看到亚显微结构,特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等。但暗视野显微镜对样品的细节构造分辨不清楚。 偏光显微镜 偏光显微镜(polarizing microscope)和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器)。显微镜的载物台可以旋转,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线 物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。 相差显微镜 环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种: (1)A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波 8 相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。 (2)B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,结构比周围介质更加变暗,形成暗反差(或称正反差)。 人的眼睛只能鉴别可见光的波长(颜色)和振幅的变化,不能鉴别相位的变化。 大多数生物标本高度透明,光波通过后振幅基本不变,却存在相位的变化,人的眼睛感觉不到。 相差化并产生的差异。相位指在某一时间上,光的波动所达到的位9 。 小,肉眼很难分辨。相差显微镜利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,通过改变相位差,并利用光的衍射和干涉现象,把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。 微分干涉显微镜 其基本原理是:来自光源的自然光经过起偏镜后成为线度方位角(入射光偏振方向与晶体光轴之间的夹角)垂直入射到第一块渥氏棱镜,这时入射偏光分解为振动方传播方向一致的O光和E光,穿过第一块渥氏棱 10 镜的中心点后,由于晶体光轴方向的改变,O光和E光从中心点散发开一个很小的角度,经过聚光镜后产生出间隔只有1um2个点。由于光线束光线的相位都发生了变化,带有标本2个邻近点的相位差信息的这2束线偏振光通过物镜后,会聚在第2块渥氏棱镜的中心点,组合在一起的这2束线偏振们通过检偏镜后成为振动面相同、频率相同且具有一定相位差的相干光束,因而在中间像平面上形成干涉的物像。 只分开1标本内邻近两点的光程差被显微镜中特殊的光学系统转变为振幅(光强度)的变化,从而可观察到标本内细微的结构, 11 所以称为微分干涉差显微镜(DIC显微镜)。 与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。 DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 荧光显微镜 荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品,只要样品中含有可产生荧光的成分,它 12 便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光,而释放的荧光也会有特定的波长,因而用作特异性的鉴定十分有效。 荧光,但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料,而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光,再释放出特定的 体视显微镜 体视显微镜又称:实体显微镜或称操作和解剖显微镜。是 13 一种具有正像立体感的目视仪器。 其光学结构原理是由一个共用的初级物镜,对物体成像后的两个光束被两组中间物镜(亦称变焦镜)分开,并组成一定的角度(称为体视角),一般为12度--15度,再经各自的目镜成像。进入两眼的光各来自一个独立的路径,这两个路径只夹一个小小的角度,因此在观察时,样品可以呈现立体的样貌。 它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置,两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角,以此形成三维空间的立体视觉图像。 它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的,因此又称为“连续变倍体视显微镜”(Zoom—stereo microscope)。 14 激光共聚焦显微镜 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。 在共聚焦显微镜的载物台上所加装的微量步进马达,可驱动载物台在扫描过程中按照设定步距移动,以使物镜聚焦于样品的不同层面上并采集该层的荧光图像,从而得到样品按照深度排列的各个横断面的一系列荧光图像。 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号 15 放大,灵敏度大大提高。 高质量数字图像 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM以激光为光源,激光具有单色性强、方向性好、高亮度﹑相干性好等优点,可以避免普通显微镜的缺点。 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光,要观测多种荧光标记的样品需要多次观测,对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描,多通道同时探测。 定位更精确:不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。 16 篇四:生物光学显微镜种类 光学显微镜 将微小物体或物体的微细部分高倍放大,以便观察的仪器或设备。它广泛应用于工农业生产及科学研究。生物学和医学工作者在业务中也经常使用显微镜。大致分为光学显微镜和电子显微镜。 光学显微镜即以可见光为光源的显微镜。普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分(图1)。其基本光学原理如图2,图中左边小的凸透镜代表短焦距的一组透镜,称物镜。右边大的凸透镜代表长焦距的一组透镜,称目镜。被观察的物体(AB)放在物镜焦点(f1)稍外的地方。物体的光线通过物镜后在目镜焦点(f2)稍内方形成一个倒立的放大实像(BA’)。观察者的眼睛通过目镜将该实像(BA’)进一步放大为一个倒立的虚像(B″A″)。 目镜位于显微镜筒的上方,一般由两个凸透镜构成。它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外,也限制了眼睛所观察的视野。按放大率分,常用目镜有5倍、10倍和15倍三种。 物镜一般位于显微镜筒的下方,接近所观察的物体。由8~10片透镜组成。其作用一是放大(给物体造成一个放大的实像),二是保证像的质量,三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍(4×)、中倍(10×或20×)、高倍(40×)和油浸物镜(100×)。多个物镜共同镶在换镜转盘上,可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。 显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数,如目镜为10倍,物镜为40倍,则放大倍数为40×10倍(放大400倍)。优良的显微镜可放大2000倍,可分辨相距1×10-5cm的两点。 当白光通过凸透镜时,波长较短的光(蓝紫色),其折射度大于长波长的光(红橙色),因此,成像时在像周出现各色光谱围绕,并且有一圈蓝色或红色的辉光,这种颜色上的缺陷称为色差。由于光线进入(和离开)透镜镜面各部分的角度不同,从透镜四周透过的光线与从透镜中心透过的光线相比,其折射角度较大。因此,成像时在像周出现模糊而歪曲的影像。这种成像面弯曲的缺陷称为球面差。一系列形状、结构和距离不同的凸和凹透镜组互相配合,便能最大限度地纠正色差和球面差,形成一个明亮、清晰而准确的影像。这就是目镜或物镜分别由一组透镜构成的缘故。这种透镜称为平场消色差透镜。 光线从一种介质(如空气)投射到另一种较为致密的介质(如玻璃)中时会弯向“法线”(与介质交界面垂直的一条线中的BOA线。光线由致密介质(玻璃)进到不致密介质(空气)中时会偏离“法线a)。当光线穿过聚光镜玻璃(折射率为1.51)进入空气时同样会偏离,向外折射,因此进入物镜的光量减少很多,像的分辨力也降低。使用100倍物镜时,如果在物镜和盖玻片之间充以油液(折射率同样为1.51)以隔绝空气,则光线几乎可以不折射地进入物镜,这就增加了像的亮度和分辨率。这种物镜称为油浸物镜(图3b)。 聚光器位于显微镜台的下方,可会聚来目光源的光线,将光量集中于标本,使标本受到光强适度的均匀照射。聚光器的下端装有孔径光阑(光圈)以控制光束的粗细。 普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方,为特制的照度均匀的强光灯泡,并且配有可变电阻,可以改变光线的强度。 由于普通光学显微镜的光源光线自镜体下方向上透射,通过聚光镜、物镜,达到目镜,因此在医学及生物学研究中必须将被观察的样品切成能透过光线μm的薄片,并且要进行染色以显示不同的组 织和细胞等细微结构。整个加工过程称常规组织制片技术,包括选取适当的组织材料经甲醛(福尔马林)液固定,逐级酒精脱水,石蜡包埋,用切片机将组织切成薄片裱在玻璃片上,再经苏木素—伊红染料着色,最后将组织玻片封固在光学树脂胶内。制好的组织玻片可长期保存。 显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端,它们的距离是固定的。将组织玻片放在载物台上,旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。组织切片进入物镜第一焦平面,目镜内即可见标本内的组织影像。然后用细调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。 医学和生物学常使用的光学显微镜有下列12种: 暗视野显微镜在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器(图4),来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射,形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的,视野中直径大于0.3μm的微粒将光线散射,其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。 实体显微镜由双筒目镜和物镜构成。放大率7~80倍。利用侧上方或下方显微镜灯照明。在目镜内形成一个直立的放大实像,可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。 荧光显微镜在短波长光波(紫外光或紫蓝色光,波长250~400nm)照射下,某些物质吸收光能,受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波(蓝、绿、黄或红光,波长400~800nm),这种光称荧光。某种物质在短光波照射下即可发生荧光,如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光,称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料(如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等)染色后,在短光波照射下才能发出荧光。荧光显微镜的光源为高压汞灯,发出的紫外光源经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆氏分色镜。分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只允许特定波长的荧光通过)以保护眼眼及降低视野暗度(图4)。荧光显微镜的特点是灵敏度高,在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在,其对比约为可见光显微镜的100倍。30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。 偏光显微镜从光源发出的光线通过空气和普通玻璃时,在与光线垂直的平面内的各个方向以同一振幅进行振动并迅速向前方传递,这是光的波动性原理。 空气与普通玻璃为各向同性体,又称单折射体。如果该光源的光通过一种各向异性体(又称双折射体)时,会将一束光线分为各只有一个振动平面的,而且振动方向互相垂直的两束光线。这两束光线的振动方向、速度、折光率和波长都不相同。这样只有一个振动平面的光线称偏振光。偏光显微镜即利用这一现象而设计。偏光显微镜内,在物镜与目镜间插入一个检偏镜片,光源与聚光器间镶有起偏镜片,圆形载物台可以作360°旋转(图5)。起偏与检偏镜片处于正交检偏位时,视野完全变黑。将被检物体放在显微镜台上。若被检物为单折射体,则旋转镜台,视野始终黑暗。若旋转镜台一周,视野内被检物四明四暗,则说明被检物是双折射体。许多结晶物质(如痛风结节中的尿酸盐结晶、尿结石、胆结石等),人体组织内的弹力纤维、胶原纤维、染色体和淀粉样原纤维等都是双折射体,可借偏振光显微镜术检验,进行定性和定量分析。 位相显微镜又称相差显微镜或相衬显微镜。普通光学显微镜之所以看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像,是因为通过样品的光线变化差别(反差)很小。标本染色后改变了振幅(亮度)和波长(颜色),影响了反差而获得图像。但是染色会引起样品变形,也可使有生命的机体死亡。要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用位相显微镜。位相显微镜的原理是两个光波因位相差而互相干涉,出现光波强弱和反差的改变而成可见影像。点光源发出的光线可以表现为正弦波图形(图6a)。两个波峰间的距离为波长,波的振幅表示光的亮度(振幅大、亮度高)。设想同一光源发出的两条光波,分别同时通过空气及某种透明介质。在通过一定厚度的某种透明介质时,光波的速度就会降低,但是光的亮度未变。光波在通过该透明介质后比一直在空气中前进的另一条光波迟滞了波长,因而两条光波出现了位相的变化(位相差)。但人眼不能分辨这两条平行光线的位相差。如果这两条光波射到光屏的同一点上,而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长,即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失,或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强。 位相显微镜的基本结构与普通光学显微镜相同。不同之处在于:物镜镜头上面,在物镜第二焦平面装有一块圆盘状的位相板(图6b)。聚光器下面,在聚光器第一焦平面装有环形光束,光束上刻有狭窄的缝隙可通过环形强光(图6c)。如图6d所示,环形光束A点发出的光线经过聚光器后成为平行光线。光线通过载物台上的样品时,因样品内各个质点(如b点)的折射率不同而受到干涉,发生衍射,即分为未偏向波(实线)和偏向波(虚线)。未偏向波通过物镜聚焦于位相板A点上成像,然后通过位相板,均匀地分布在标本像平面上成为背景。偏向波通过物镜后从位相板A点周围通过位相板同样聚焦在像平面的B上。换句话说,未偏向波和偏向波是分别通过位相板的不同部位。在位相板上不同的区域涂有不同的涂层,可以分别改变未偏向波或偏向波的速度和亮度,由此两种光波出现了位相差,差了半个波长或一个波长,它们在像平面的合波就出现明暗对比,样品内的各个细节也就能看得见。 总之,位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等,产生光线的相位差,使新鲜标本不必染色就可以看到,而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构,还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究,进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察,并可进行量度与比较。 倒置式显微镜普通显微镜镜的物镜头方向向下接近标本。倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置,因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。载物台面积较大,在物镜上方,载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源。物镜和聚光器可装配位相显微镜的附件。放大率16~80倍。组织培养瓶和培养皿可以直接放在载物台上,进行不染色新鲜标本及活体、细胞的形态、数量和动态观察。可进行多孔微量生物化学及免疫反应平板的结果观察。倒置式显微镜可换用普通亮视野光学镜头;可装配偏振光、微分干涉差、荧光附件进行观察。 微分干涉差显微镜(DIC)又称干扰或干涉显微镜。能看到和测定微小的位相变化,与位相显微镜相似,使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化,从而增强反差。在普通光学显微镜的基本结构上安装偏光和干涉部件,以及360°旋转载物台。它又利用偏振光的干涉原理。如图7所示,在光源上方安置有起偏镜片和光束分解棱镜。从起偏镜片出来的直线偏振光通过光束分解棱镜后,分成互相垂直振动的两条直线偏振光。两条光线经聚光器折射后射向样品。因样品内各个质点的折射射率不同,部分光波的位相改变及因干涉而发生横向偏移。两条光线通过物镜后经第二组光束分解棱镜相合并,由检偏镜发生干涉。终末像的每一个点是由物体上同一点的两个互相重叠的不同图像构成的一种混合像,从而使肉眼得以辨识。 微分干涉差显微镜同样可以观察到在普通亮视野中看不见的无色透明物体,可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感,较位相显微镜的影像更细致、更逼真。可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。如果用白光照明,不同位相表现为各种颜色,转动载物台,颜色会发生变化。单色光照明产生明暗反差, 各种成分呈现不同的对比度。微分干涉差显微镜又可以作为一种高度精密的超微量光学天平来使用,用以估测的干物体的精确质量可以小到1×-14克。当细胞中所含固体物质的浓度增加百分之一时,其折射率相应增加0.0018。细胞各相成分的折射率可以根据它与相关区域(悬浮液区)间位种的不同而估计,从而可进一步算出一个细胞中某些成分的干燥重量。 摄影显微镜现代高质量显微镜均可安装显微照相的各种附件,可以及时完整地保留科学资料。用于照相的显微镜要求光学系统和机件结构精密,镜体坚固稳定。它装配三目镜筒,其中两个45°角观察用目镜镜筒和一个中央垂直镜筒安装135照相机、曝光测量附件、照相目镜及取景镜头,可以进行取景和调焦。聚光器能调节视场中心并配有孔径光阑使视场照明均匀。镜座有可调节视场光阑,有电压表和电压显示灯。有可变电阻调节照明亮度。照明光源为6~12伏40~100瓦卤素灯泡。80年代的自动曝光显微照相装置具有自动卷片,自动测光、自动控制曝光,测量和调整色温以及倒易律失效的补偿等各项功能,均用电子计算机自动控制,可以进行黑白感光片、彩色负片和彩色幻灯片的投照。 中央垂直镜筒又可以安装电视摄像装置或16mm电影摄影机及控制装置,可对活体标本进行定时定格或连续的摄影记录。 万能研究用摄影显微镜系统集普通亮视野、暗视野、偏振光、荧光、位相、微分干涉差、显微摄影等各项功能于一个系统中。还有电子计算机控制的低倍摄影自动聚焦、自动转换物镜、聚光器自动匹配、自动调整光源亮度等功能。机身安装两个135照相机,一个4×5英寸大版照相机。 可另外安装电视摄像和16mm电影摄影装置,同样具有自动卷片、自动测光、自动控制曝光、测量和调节色温、倒易体失效补偿等多项功能。 电子显微镜光学显微镜的分辨本领由于所用光波的波长而受到限制。小于光波波长的物体因衍射而不能成像。最高级的光学显微镜的分辨本领的限度约200nm(2000)。为了突破这一限度,可采用电子射线来代替光波。电子微粒以高速运动时,其行为类似光波的传播过程。运动电子的波长随其速度而定,在增压达50万伏时,其波长为0.001nm(0.01),即电子射线的波长约为可见光的十万分之一,其分辨本领的极限约为4,其放大倍数比最高级的光学显微镜要高很多级。以电子射线为电子光源的显微镜称为电子显微镜。现代医学和生物学使用的电镜分辨率为5~10,即放大率为10~20万倍。 由于标本厚薄不同,超薄切片机切出的很薄的标本,可用透射式电子显微镜观察。不能切得很薄的标本可用扫描式电镜进行观察。 透射式电子显微镜(TEM)是最常用的电子显微镜,由电子枪、电磁透镜系统、荧光屏(或照相机)、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真空泵系统、操纵台等部分组成。电子枪相当于光学显微镜中的光源,供应和加速从阴极热钨丝发射出来的电子束。电镜所用的电压一般在20~30万伏特,才足以使电子枪里的电子以高速飞出。电子通过聚光透镜,达到标本上,因为标本很薄,高速电子可以透过,并且由于标本各部分的厚度或密度不同,通过的电子就有疏密之分。电压需要严格稳定才能使成像稳定,很小的电压改变就会引起严重干扰。像的亮度可以通过电子枪来控制。 电磁透镜组相当于光镜中的聚光器、物镜及目镜系统。电子束通过各个电磁透镜的圆形磁场的中心时可被会聚而产生像。电镜的透镜系统由4组电磁透镜组成,包括聚光透镜、物镜、中间透镜和投射透镜(目镜)。可改变聚光透镜的电流使电子束对标本聚焦并提供“照明”。物镜靠近标本的焦点上。通过物镜、中间镜和投射镜的三级放大,能在一定的距离处得到高倍的放大像,最终形成的像投射到荧光屏上。在荧光 屏部位可换用黑白胶片以制取相片底板。改变电磁线圈中的电流量从而使电磁透镜调焦,并产生不同的放大率(图8)。 为了尽量减少电镜中电子与空气分子相碰撞而产生散射的机会,镜筒中的真空度要求很高,因此密封的镜筒与真空泵相连。由于标本需置于真空的镜筒内,因此不能检查活材料。 光镜主要利用可见光波作为光源,样品染色后改变了光的波长(颜色)和振幅(亮度),影响了反差从而得到图像。电镜使用电子射线。电子束的穿透力不强,所以供电镜检查的标本必须切到薄至50~100nm厚度的切片。电镜切片的制作步骤与光镜切片类似,也是由固定、脱水、包埋、切片和染色等程序组成:首先从欲观察的标本上取材,体积约1mm3。通过戊二醛和四氧化锇双固定后,逐级酒精(或丙酮)脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切片。在电镜中像的形成是组织片各个部分对电子束的电子产生不同散射的结果,标本中致密的地方(细节)散射强。可使用各种重金属盐染色以增加反差,常用的是醋酸铀和枸橼酸铅复染。由于电子束穿不透玻璃,染好的薄膜切片放在小铜网格上作电镜观察。 冷冻蚀刻技术是50年代发明、后来经过改进的一种新的电镜标本加工技术 其主要原理是把液氮内快速超低温(-200)冷冻的生物标本放在真空冷冻装置里断裂,从而将不同部位的细胞器内部结构暴露出来,表现出高低不等的三维结构。在新形成的折断面上喷镀一层铂金碳膜(复型)。将已镀膜标本在强酸或强碱性腐蚀溶液里消化,复型膜即漂浮、经打捞、清洗,放在小铜网上进行电镜观察和照相。冷冻蚀刻技术在细胞生物膜结构(如细胞膜、线粒体、内质网等)的研究上发挥了重大作用。 扫描式电子显微镜(SEM)标本较厚的表面要产生一个电子光学图像就要采用电子扫描法(图9)。扫描电镜的电子枪和电磁透镜的结构原理类似透射电镜。电子枪产生的大量电子通过三组电磁透镜的连续会聚形成一条很细的电子射线(电子探针)。这条电子射线在电镜筒内两对偏转线圈的作用下,顺序在标本表面扫描。由于来自锯齿波发生器的电流同时供应电镜镜筒内的和显示管的两组偏转线圈,使得显示器的电子射线在荧光屏上产生同步扫描。从标本上射出的电子经探测器收集,被视频放大器放大并控制显示管亮度。因此在荧光屏上扫描的亮度被标本表面相应点所产生的电子数量所控制,因而在荧光屏上显示出标本的高倍放大像。通过控制两套偏转线圈的电流便可控制放大率的倍数。另外安装有一个同样的照相用同步扫描显示管。 扫描电镜标本制作中,既要脱水又要基本保持其自然状态,因此使用标本的临界冷冻干燥技术:将组织表面清洗干净,经戊二醛和四氧化锇双重固定,逐级丙酮脱水。由于乙酸戊酯与液化Co2置换十分容易,因此首先用梯度乙酸戊酯置换丙酮。然后将标本放入密闭耐压室内,导入液态Co2,使之浸没标本。很快Co2将标本内乙酸戊酯完全置换出来,将后者排出耐压室。同时耐压室内的液态Co2与迅速蒸发的气态Co2分子之间的互变达到动态平衡。使温度逐渐上升,液态Co2蒸发加快而密度相应降低。达到Co2的临界温度31.1时,气、液二相密度相同,二相的差异完全消失,即达到相的平衡,此时表面张力为零。使温度继续保持在稍高于临界温度的条件下,缓慢排出Co2气体,当Co2排尽时,标本即已干燥。取出干燥好的标本,经真空喷镀一层碳合金,或放入离子镀膜机内镀铂和金,以增加标本的导电能力,加强反差和增强标本的稳定性。然后即可进行扫描电镜观察。 扫描电镜具有分辨率高、景深长、视野广、显示三维立体结构、便于观察和标本制备简单等许多优点,在生物学及医学上应用愈来愈多,用以观察和研究生物标本的表现形态和内部立体结构。扫描电镜的分辨本领已达到70┱的水平,已可以直接观察脱氧核糖核酸(DNA)的分子结构。 将微小物体或物体的微细部分高倍放大,以便观察的仪器或设备。广泛应用于工农业生产及科学研究,在生物学和医学工作中也经常使用。大致分为光学显微镜和电子显微镜。 光学显微镜以可见光为光源的显微镜。原始的光学显微镜是一个高倍率的放大镜。曾记载在1610年前意大利物理学家伽利略已制作过复式显微镜观察昆虫的复眼。这是一种已具目镜、物镜和镜筒等装置,并固定在支架上的显微镜。荷兰人A.van列文虎克是第一个用显微镜作科学观察的人。到18世纪显微镜已有许多改进,应用比较普遍,已作为一种商品进行生产。1886年生产出具复消色差油镜的现代光学显微镜,达到了光学显微镜的分辨限度。从19世纪后期至20世纪60年代发展了许多类型的光学显微镜,如:偏光显微镜、暗视场显微镜、相差显微镜、干涉差显微镜、荧光显微镜。 80年代后期又发展了一种同焦扫描激光显微镜。 普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分。目镜位于显微镜筒的上方,一般由两个凸透镜构成,它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外,也限制了眼睛所观察的视野。按放大率分,常用目镜有5倍、10倍和15倍3种。物镜一般位于显微镜筒的下方,接近所观察的物体。由8~10片透镜组成。其作用一是放大(给物体造成一个放大的实像),二是保证像的质量,三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍(4×)、中倍(10×或20×)、高倍(40×)和油浸物镜(100×)。多个物镜共同镶在换镜转盘上,可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。 显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数,如目镜为10倍,物镜为40倍,则放大倍数为40×10倍(放大400倍)。优良的显微镜可放大2000倍,可分辨相距1×10-5厘米的两点。 聚光器位于显微镜台的下方,可会聚来自光源的光线,将光量集中于标本,使标本受到光强适度的均匀照射。聚光器的下端装有孔径光阑(光圈)以控制光束的粗细。 普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方,为特制的照度均匀的强光灯泡,并且配有可变电阻,可以改变光线的强度。 显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端,它们的距离是固定的。将组织切片放在载物台上,旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。组织切片进入物镜第一焦平面,目镜内即可见标本内的组织影像。然后用细调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。 电子显微镜以电子射线年由M.诺尔和E.鲁斯卡在柏林制造成功第一台实用的透射电子显微镜。其成象原理和光学显微镜相似,它用电子束作为照射源,用电子透镜代替玻璃透镜,整个系统在高真空中工作。由于电子波长很短,所以分辨率大大提高。50年代扫描电子显微镜在英国首先制造成功。它利用物体反射的电子成像。扫描电子显微镜景深大,放大倍率连续可变,适用于研究微小物体的立体形态和表面的微观结构。 光学显微镜的分辨本领由于所用光波的波长而受到限制。小于光波波长的物体因衍射而不能成像。最高级的光学显微镜的分辨本领的限度约200纳米(2000埃)。为了突破这一限度,可采用电子射线来代替光波。电子微粒以高速运动时,其行为类似光波的传播过程。运动电子的波长随其速度而定,其放大倍数比最高级的光学显微镜要高很多级。 由于标本厚薄不同,超薄切片机切出的很薄的标本,可用透射式电子显微镜观察。不能切得很薄的标本可用扫描式电镜进行观察。 1

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